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本试剂盒适用于从大量动物细胞和易裂解动物组织快速提取总RNA，使用独特的基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于PCR，荧光定量PCR。

本试剂盒基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，采用独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。
  
• 基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温(4℃或-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温(15～25℃)下进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均可在室温完成，使用可容纳50mL离心管的离心机。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过100mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过6×10⁷细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过6×10⁷，组织不超过200mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本试剂盒采用独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时应注意以下几点。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀、OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

• 组织培养细胞
  
  • 收集<2×10⁸悬浮细胞到一个合适大小离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
    
  • 10000～13000×g离心20秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
    
  • 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加5mL（<10⁸细胞）或10mL（1～2×10⁸细胞）裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。
    
  • 匀浆：（处理细胞量极少时<2×10⁶一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆）。用带钝针头的一次性10mL(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次以上或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
    
  • 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
    
  • 立刻接步骤3。
• 动物组织（例如鼠肝脑）
  
  • 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入5mL(<250mg组织)或者10mL(400～500mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆1分钟。
    
  • 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(250mg/500mg)转入装有5mL/10mL组织裂解液RLT Plus的50mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性10mL(配0.9mm针头)注射器剧烈抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
    
  • 将匀浆后裂解物10000～13000×g离心5分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
    
  • 立刻接步骤3。
• 立刻10000～13000×g离心5分钟，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为5mL/10mL，滤过时候损失体积应该减去），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 将混合物加入一个吸附柱RA中（吸附柱放入收集管中），10000～13000×g离心3分钟（确保全部通过，膜上无残留液体，否则应加大转速和时间），弃掉废液。
  
• 加10mL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12000×g离心3分钟，弃掉废液。
  
• 加入10mL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），10000～13000×g离心1～2分钟，弃掉废液。加入10mL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000×g离心5分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加500μL～1mL RNase-free H2O，室温放置3分钟，12000×g离心2分钟。
  
• 如果预期RNA产量＞0.6mg，加300～500μL RNase-free H2O重复步骤9，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。